全息數字顯微鏡是數字全息技術在顯微領域的應用，也被稱為全息顯微術。與其他顯微技術相比，全息數字顯微鏡并不直接記錄被觀測物體的圖像，而是記錄含有被觀測物體波前信息的全息圖，再通過計算機對所記錄的全息圖進行數值重建來得到被測物體的相位和振幅(光強)信息，進而完成數字三維重構。打個形象的比方來理解數值重建這個過程，就是利用計算機算法代替傳統光學顯微鏡中的成像透鏡。

 

　　其他一些同數字全息顯微技術相關的顯微術包括干涉顯微鏡、光學相干斷層掃描技術以及衍射相差顯微鏡。這些顯微技術的共同點是都有一束參考波前，用來同時獲得振幅和相位信息，信息被數字圖像傳感器采集，再通過計算機重建形成被測物體的圖像。與之相比，傳統的光學顯微鏡由于沒有參考波束，只能記錄振幅(光強)而沒有相位，因此并不能讀取物體的三維信息。

 

　　全息數字顯微鏡通過干涉產生的全息圖被CCD傳感器采集，經過電腦特定算法計算，重建微觀物體的三維圖像。全息圖(Hologram)是由若干干涉條紋構成的，而要產生干涉條紋需要使用單色相干光源，比如說激光。通過激光器發出的激光主要有兩種典型的光路布局，反射式和透射式。

 

　　從激光器發出的激光被分為兩束光，一束通過多個反射鏡直接投射到分光鏡，稱為參考光R;另外一束則照射物體表面，經物體反射后攜帶表面形貌的波前(相位和振幅)信息，并通過顯微物鏡返回分光鏡，稱為物光O。參考光R和物光O在經過分光鏡時產生干涉條紋形成全息圖，并由CCD傳感器記錄。

 

　　與反射式相同的是激光開始都被分為兩束，參考光R和物光O。與反射式不同的地方是，物光O是穿透物體之后再與參考光R形成干涉條紋。因此投射式光路要求物體對此波長的激光來說是透明的。